低温保存

低温冷冻过程对细胞的损伤主要包括冰晶损伤和溶质损伤。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的水晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降,细胞内外都结冰,产生冰晶损伤。这就构成了低温冷冻消融的直接机制。

为对抗这些损伤机制,对细胞进行冷冻保存,需要在冷冻保护剂、冷冻速度、复温速度等多方面采取措施,对于不同的细胞采取不同的精确设计、各参数互相关联的方案,以提高细胞复苏后的存活率。

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲,只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中,并以最合适的冷冻速度冷冻,可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说,在不加冷冻保护剂的情况下,无最适冷冻速度可言,也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中,并以0.3~600℃/min的冷冻速率降温冷冻,98%以上的细胞会死亡;而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时,98%以上的细胞都可存活。

冷冻速度是指降温的速度,直接关系到冷冻效果。不同的冷冻速度既能使细胞内发生不同的生理变化,也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢,还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤。当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会形成较多水晶,造成细胞膜及细胞器的破坏,产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速度不同。人红细胞的最适冷冻速度分别为200℃/min。对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其最适冷冻速度,以保证获得最高的冷冻存活率。通常保存人体细胞会将其置于含有冷冻保护液的试管中,并将试管迅速放入液氮中以期获得高达数百℃/min的冷冻速度。

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速度不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说,复温速度越快越好,此时细胞内外不会重新形成较大的冰晶,也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间,从而无冰晶损伤和溶质损伤产生,冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。常规的做法是,在37℃水浴中,于1~2分钟内完成复苏。复温速度过慢,细胞内往往重新形成较大水晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快,往往在极短的时间内发生。

细胞冷冻保存是一项细致而精确的工作,稍有不慎即会导致冷冻存活率的大幅度下降甚至细胞全部死亡。